วันที่ออกฉาย: 1 พฤษภาคม 2550 (ประเทศไทย)
ผู้กำกับ: แซม ไรมี
ภาคก่อน: ไอ้แมงมุม 2
ประพันธ์ดนตรีโดย: คริสโตเฟอร์ ยัง
นักแสดง: โทบีย์ แมไกวร์, เคิร์สเตน ดันสท์, โทเฟอร์ เกรซ, เจมส์ แฟรนโก,
ปีเตอร์ได้ทราบว่าฆาตกรที่แท้จริงของลุงเบนคือ โจรตกอับ ฟลินต์ มาร์โก ซึ่งฟลินต์ได้หลบหนีการจับตัวของตำรวจโดยการเข้าไปในห้องทดลองลับแห่งหนึ่ง ซึ่งเกิดอุบัติเหตุทางด้านเครื่องมือ ทำให้ฟลินต์กลายเป็นเครื่องมือทดลองเอง
หลังจากการทดลอง ฟลินต์ ได้ตื่นขึ้นมาพร้อมทรายทั้งตัว ทำให้เขาได้ฉายาว่า แซนด์แมน หลังจากนั้น เขาจึงได้ใช้พลังนี้ในความชั่ว ในด้านอาชญากรรม เมื่อปีเตอร์รู้จึงได้ตั้งสัญญาว่าจะจับฟลินต์มาภายใต้อาณัติแห่งความยุติธรรมและความแค้นส่วนตัว
หลังจากพิษแค้นฝังอยู่ในจิตใจของปีเตอร์ เขาได้ถูกครอบงำโดยสารสีดำที่มาจากนอกโลก เรียกว่า ซิมเบียท ซึ่งสารนี้ได้ครอบงำชุดน้ำเงินแดงของสไปเดอร์แมน เป็นชุด สีดำและสารนี้ให้พลังแก่ปีเตอร์มากกว่าที่เขาเคยมี ทำให้เขามั่นใจและหลงระเริงในพลังของตัวเองนี้ แต่สารนี้นอกจากจะให้พลังแล้ว มันยังให้ความมืดด้านจิตใจแก่ปีเตอร์ด้วยซ้ำ ทำให้ปีเตอร์มีอยู่หนทางเดียว คือ การทำลายชุดนี้ลงเสีย
ด้านแฮร์รี่ เพื่อนสนิทของปีเตอร์ หลังจากที่ได้รู้ความจริงเกี่ยวกับ สไปเดอร์แมน ซึ่งคือเพื่อนของเขาเอง ทำให้เขาแทบบ้าคลั่งขึ้นมา และค้นพบที่เก็บอาวุธลับของกรีน ก็อบลิน หรือพ่อของเขา ซึ่งแฮร์รี่ได้ดัดแปลงอาวุธนี้ให้ทันสมั้ยและเหมาะมือเขากว่า เมื่อดัดแปลงเสร็จ เข้าก็ได้เข้าไปสู่ห้องสีเขียว และเปลี่ยนตัวเองเป็นก็อบลินอย่างสิ้นเชิง หลังจากการเตรียมพร้อมแล้ว เป้าหมายของแฮร์รี่คือ "ฆ่าปีเตอร์ ปาร์คเกอร์"
เอ็ดดี้ บร็อก เป็นคู่ปรับของปีเตอร์ในหลายด้าน ทั้งด้านการงาน ในการแย่งงานนักหนังสือพิมพ์ ในบริษัทบิวเกิ้ล ทั้งด้านความรัก ของ เกว็น สเตซี่ และอีกหลายด้าน ทำให้เอ็ดดี้โกรธแค้นปีเตอร์อย่างมาก
หลังจากที่ปีเตอร์ได้แย่งงานนักหนังสือพิมพ์แล้ว เอ็ดดี้ได้ไปสู่โบสถ์แห่งหนึ่งเพื่อที่จะฆ่าตัวตาย แต่เขาไม่สามารถทำแบบนั้น เนื่องจากอยู่ดีๆ ซิมเบียทได้ตกลงมาจากเพดาน และครอบงำจิตใจของเขา และร่างกายไปด้วย ทำให้ตัวเอ็ดดี้กลายเป็น วีนอม คู่ปรับสำคัญของสไปเดอร์แมน และวีนอมมีเป้าหมายเดียวคือ เด็ดหัวของสไปเดอร์แมน ออกจากบ่า
